آشنايي با وسايل آزمايشگاهي :

آنس ( فليدوپلاتين ) : كه به دو نوع مي باشد نوك تيز و حلقه اي كه براي انواع كشت ها در محيط هاي مختلف به كار مي رود .

پيست اتوماتيك : پيستي بسيار حساس و دقيق مي باشد كه داراي تنظيمي در قسمت فوقاني خود مي باشد كه مي تواند از 1 سي سي تا 1000 سي سي تنظيم شود .  اين دستگاه داراي قسمت هاي پلاستيكي مي باشد كه براي برداشتن مواد از آنها استفاده مي شود و يكبار مصرف مي باشند . اين اجزاي پلاستيكي سر سمپلر مي باشند .

فور : دستگاهي براي استريل كردن

انكوباتور ( گرم خانه ) : كه بعد از كشت برخي محيط ها را براي اينكه در محيط مناسب خود قرار گيرند در آن قرار مي دهند . دماي آن قابل تنظيم بوده همچنين مي توان زمان را نيز براي آن تعريف نمود .

اتوكلاو : دستگاهي شبيه به يك زود پز بزرگ مي باشد كه براي استريل كردن از آن استفاده مي شود.

استريليزاسيون :

روندي است كه در طي آن همه اشكال ميكروبي را اعم از اشكال فعال و اسپورها را از بين مي بريم و آن ابزار و يا آن ماده مورد استفاده را عاري از هر گونه ميكروب مي كند .

استريليزاسيون به دو صورت خشك و رطوبي انجام مي شود .

Stril: ( Dry – wet – filter )

روش هاي كشت باكتري :

هدف از كشت باكتري :

1-   باكتري را بتوانيم جدا ايزوله كنيم ( خالص كنيم ) مثلا حيواني كه مبتلا است ( بيمار است ) مي توانيم عوامل بيماريزا را از او جدا كنيم و با شناسايي عوامل بيماريزا پي به ماهيت بيماري ببريم .

2-   از كشت باكتريايي كمك مي گيريم براي درمان بيماري ( تست آنتي بيوگرام ) كه در اين تست ها باكتري خالص شده را در اختيار داريم . مي توانيم داروهاي متعدد را روي آن آزمايش كنيم و به هر كدام از داروها جواب داد در مورد انسان و يا دام استفاده كنيم .

3-   تهيه واكسن ها : كشت هاي خالص را بدست مي آوريم بعد آنتي ژنهاي آن باكتري ها را جدا مي كنيم و از آنها واكسن تهيه مي كنيم .

محيط هاي كشت :

الف : محيط كشت مايع : (Broth) آبگوشت ، مثال انواع محلولهاي قندي مثل گلوكزبرات .

ب : محيط هاي جامد : Agar :

يك پلي ساكاريد است . پلي ساكاريد كمپلكسي است كه باكتري ها مي توانند آن را تجزيه كنند . ( سفت كننده است ) . ما به طور معمولي محيط هاي جامد را داخل پليت تهيه مي كنيم ( يك تعدادي داخل لوله ) محيط هاي مايع هميشه داخل لوله تهيه مي شوند .

ج : حالت نيمه جامد :

آگار را به ميزان كم دارد حالت ژل مانند . از اين محيط ها عمدتا جهت بررسي فاكتور حركت در باكتريها استفاده مي كنيم و در لوله هم تهيه مي شوند .

روش هاي كشت :

1-   روش شعاعي :

2-   روش كشت T:

3- روش كشت ممتد :

4-كشت يك چهارم (4/1

روش هاي كشت در لوله :

نوترينت آگار زرد رنگ طلايي مي باشد .

چهار محيط را ما در اين آزمايش كشت داديم .

1-   در يك پليت كه زرد رنگ بود ( نوترينت آگار ) از محيط e₃ كشت داديم .

2-   در مايع قندي كه قرمز روشن بود از محيط e₁ كشت داديم .

3-   در SIM كه زرد روشن بود از محيط e₃ كشت داديم .

4-   در TSI كه نارنجي رنگ بود از محيط e₂ كشت داديم .

 

رنگ آميزي باكتريها :

Whole colony : اشكال كلوني :

Pnctiform:                              Circular:                   

 

                    ☼☼☼☼☼☼                     ЖЖЖЖ

Filamentus: ☼☼☼☼☼☼     Rhizoid: ǼĦĦΨΨ                Ivregular :

                   ☼☼☼☼☼☼

 

Flat:                            Elevation: (شكل جانبي , چقدر بالا رفته)   Raised:

 

Convex:                      Pulvinate:                               Umbonate:

 

Smooth: صاف              Roaph: خشن                Drycorn powdery: حالت پودري

Sarface appearance: جنس

انواع رنگ آميزي :

1-   ساده

2-   تفريقي

در حالت تفريقي از دو رنگ مي توان استفاده نمود كه حالت كنتراست داشته باشند . اما در رنگ آميزي ساده از يك رنگ استفاده مي شود .

هدف ما از رنگ آميزي تشخيص گران مثبت يا گران منفي بودن باكتري است .

رنگ آميزي ساده را با متيلن بلو انجام داديم .

نتايج آزمايش كشت باكتري :

كشت در پليت به صورت كلوني تك ديده مي شود . در مايع كشت بسيار عالي و به رنگ نارنجي در آمده است . سطح مورب به صورت خوب كشت شده و رنگ آن زرد تيره ( رنگ روغن مايع ) شده است كه قبلا قرمز آجري بود . در SIM مسير فرو رفتن آنس به صورت ابر مانند مي باشد .

Plate : Raised & Circular & Smooth

تهيه اسمير ميكروبي و رنگ آميزي آن :

در واقع ما در اين تكنيك باكتريهايي را كه مي خواهيم در زير ميكروسكوپ با اهداف مختلفي بررسي كنيم ابتدا بايستي كه يك گسترش را از آنها تهيه كنيم به اين صورت كه بايد يك لايه نازكي از اين جمعيت باكتريايي تهيه كنيم بعدا اينها را تثبيت مي كنيم روي لام و پس از رنگ آميزي زير ميكروسكوپ بررسي مي كنيم . براي شروع كار از يك لام تميز استفاده مي كنيم . ابتدا از آب مقطر يك مقدار بر مي داريم خيلي كم روي لام مي گذاريم بعد نوك آنس را آغشته مي كنيم و در داخل لام كاملا پخش مي كنيم بعد در فضاي آزمايشگاه بايد خشك شده و براي تثبيت از روي شعله رد مي كنيم . تا مدتي كه دست را نسوزاند . مايع را نيز بعد از استريل كردن آنس در محيط مايع فرو مي بريم و بعد يك يا دو بار در محيط فرو مي بريم و بعد روي لام جديد مي ريزيم .

رنگ آميزي گرم :در روش رنگ آميزي گرم ما از سه رنگ استفاده مي كنيم كه 2 تا از اين رنگها نقش مستقيم در اين رنگ آميزي دارند و براساس  اينكه باكتري ها چه رنگي را به خودشان خواهند گرفت مي توان آنها را بعدا دسته بندي كنيم به گرم + و گرم _ اي روش براي اولين بار در سال 1884 توسط كريستين گرند ابدا‌ء شد و به مرور زمان يك سري تغييراتي در آن به وجود آمد ولي به طور كلي اساس كار تفاوت چنداني نمي كرد .

اساس كار:

ما ابتدا از يك رنگي استفاده مي كنيم بنام رنگ اوليه Primary stain كه با اين رنگ آميزي هر دو گروه رنگ خواهند گرفت .

از يك تركيب رنگ بر استفاده مي كنيم ( De colorization agent ) .

رنگي كه باعث ايجاد كنتراست مي شود . (Coanterstain)

كه در مرحله آخر اجرامي كه به وسيله عامل رنگ بر رنگشان را از دست داده اند به اين رنگ آغشته مي شوند .

رنگ اوليه كريستال ويوله كه آبي است .

رنگ بر اتيل الكل 95% است .

رنگ آخر سافرانين يا فوشين است . (قرمز رنگ).

براي اينكه مراحل از يادمان نرود مي توانيم همواره دو كلمه كلاس و كلاف را به خاطر داشته باشيم .

اينكه چرا يكسري از باكتريها رنگ اوليه را به خود جذب مي كنند و آن را موقع استفاده از رنگ بر از دست نمي دهند و برعكس يك سري ديگر رنگشان را به راحتي از دست مي دهند بنا به يك سري اعتقادات بر مي گردد به تركيب شيميايي غشاء باكتريها . ولي شواهدي نيز وجود دارد كه تركيب غشاء نمي تواند چندان در اين امر دخيل باشد . به طور مثال مخمرها كه جزء باكتريها اصلا حساب نمي شوند و ساختار ديواره سلولي آنها نيز كاملا متفاوت از باكتريهاست . ولي در رنگ آميزي گرم به صورت گرم + ديده مي شوند لذا عقيده بر اين است كه بيشتر منافذي كه در غشاء وجود دارند و قابليت نفوذپذيري اين منافذ و يكسري پديده هاي فيزيكي در اين نحوه رنگ آميزي دخيل هستند .

1. در سطح خارجي باكتريهاي گرم + قشري از نمك منيزيم ريبونوكلئيك وجود دارد كه با رنگ كريستال ويوله و لوگول تركيب پايدار ايجاد ميكند و در اثر مواد بي رنگ كننده نيز اين رنگها از باكتري ها خارج نمي شوند و اين در حالي است كه باكتريهاي گرم منفي فاقد اين ويژگي هستند .
2. PH  ايزو الكتريكي براي باكتريهاي گرم + پايين تر از باكتريهاي گرم _ است روي اين اصل باكتريهاي گرم + در حدود 100 برابر بيشتر از گرم منفي ها كريستال ويوله و يد را جذب مي كنند و به راحتي هم اين رنگ را از دست مي دهند .
3. گفته مي شود كه كريستال ويوله و يد در داخل باكتريها با هم تركيب شده و مولكول درشتي را به وجود مي آورند ه اين مولكول نمي تواند از جدار گرم + ها خارج شود در حالي كه در گرم _ به راحتي مي تواند رنگ از طريق ديواره خارج گردد .
4. بخش اعظم Cell wall  گرم _ ها از ليپوپروتئين است و تحت تاثير ماه رنگ بر الكل و استون چربي هاي آن حل شده و كمپلكس رنگي خارج مي شود .

تذكر مهم :

اگر مدت زمان استفاده از رنگ بر طولاني شود باكتريهاي گرم+ به صورت گرم _ ديده خواهند شد . وهمچنين اگر براي تهيه لام از باكتريهاي پير و مرده استفاده شود كه اينها قدرت نگهداري رنگ را ندارد بنابراين به رنگ گرم _ در مي آيند .

روش كار:

ابتدا يك اسمير ميكروبي تهيه مي كنيم ، آن را خشك و بعد Fix مي كنيم و بعد آماده مي شود براي رنگ كردن . سطح اسمير را با كريستال ويوله مي پوشانيم يك دقيقه صبر مي كنيم . با يك پيست حاوي آب مقطر اضافي رنگ را مي شوييم بعد روي آن لوگول مي ريزيم و يك دقيقه صبر مي كنيم . بعد از اين كار اضافي اين را با آب شستشو مي دهيم . بعد از اين مرحله از رنگ بر استفاده مي كنيم . بايد دقت شود استفاده از اتيل الكل بيش از حد طولاني نشود . نهايتا روي آن سافرانين يا فوشين مي ريزيم و 45  ثانيه صبر مي كنيم و اضافي آنرا مي شوييم و خشك مي كنيم و با ميكروسكوب 100 و روغن ايمرسون بررسي مي كنيم .

گرم +             به رنگ آبي تا بنفش ( كه مال كريستال ويوله است )

گرم _             به رنگ قرمز ( كه مال سافرانين يا فوشين مي باشد )

كلاس : ك, كريستال ويوله . ل , لوگول . ا, اتيل الكل . س , سافرانين .

كلاف : ‌ ك, كريستال ويوله . ل , لوگول . ا, اتيل الكل . ف , فوشين .

موارد مورد مشاهده شده :

سرئوس :

باسيل بوده و گرم + مي باشد .

اورئوس :

كوكسي بوده و گرم + مي باشد .

ليسترا مونو سايتراژنز:

به شكل باسيل هاي بسيار كوچك بوده و گرم + مي باشد .

ايكولاي :

به شكل باسيل كوتاه بوده و گرم _ است .

نكته : ما در رنگ آميزي مرحله آخر از فوشين استفاده كرديم .

پس : اورئوس فقط كوكسي           اي كولاي فقط گرم _

رنگ آميزي اسپور :

يك سري از باكتريها مي توانند ايجاد آندسپور كنند كه اين آندسپور در مقابل شرايط محيطي مي تواند در مقابل خشكي مقاومت زيادي داشته باشد . از آنجايي كه ساختار پوششي اسپور به نحوي است كه رنگ در شرايط عادي نمي تواند وارد آن شود بنابراين از يك روش خاصي براي اين رنگ آميزي استفاده مي كنيم . به دين صورت كه ما ابتدا از رنگ ( مالاشيت گرين ) سبز مالاشيت و جهت تسهيل ورود اين رنگ به داخل اسپور آن را حرارت مي دهيم . حرارت دادن نبايد به نحوي باشد كه موجب تبخير و يا جوشيدن رنگمان شود . براي حرارت دادن مي توانيم از هات پليت استفاده كنيم ولي بايد دقت كنيم كه حرارت تا حد جوش نرسد . 2 الي 3 دقيقه به آن حرارت مي دهيم , بعد خنك مي كنيم زير آب شستشو مي دهيم و سپس ب روي آن سافرانين اضافه مي كنيم به مدت حدودا 30 تا 40 بعد رنگ اضافه را شستشو مي دهيم و بعد خشك مي كنيم  و با ميكروسكوپ 100 بررسي مي كنيم . در اين روش رنگ آميزي اسپورها به رنگ سبز و فرم هاي ديگر سلول باكتري به رنگ قرمز خواهند شد .

در همان روز محيط SS Agar تهيه كرديم به دين صورت كه در داخل200 گرم آب مقطر 12 گرم آگار اضافه كرده و به مدت 15 دقيقه در اتوكلاو مي گذاريم .

رنگ آميزي كپسول : ( رنگ آميزي منفي )

براي رنگ آميزي كپسول از Nigrosin استفاده مي كنيم . طريقه درست كردن نيگروزين بدين صورت است كه 5/0 گرم از ماده خشك نيگروزين را در 100 سي سي آب مقطر حل مي كنيم .

روش كار:

يك لام تميز انتخاب مي كنيم در قسمت انتهايي قطره كوچكي از نيگروزين را مي گذاريم با استفاده از لوپ ( آنس حلقه ) يك مقدار از كلوني را برداشته و در داخل رنگ حل مي كنيم . با لام ديگر پخش مي كنيم و بعد خشك مي شود .

محيط هاي كشت SIM و TSI را تهيه مي كنيم . ( SIM  حالت ژلوز دارد TSI حالت جامد دارد .) به دين صورت كه براي SIM 6 گرم در 200 سي سي آب مقطر كه قهوه اي رنگ مي شود . و براي TSI 65 گرم در يك ليتر حل مي كنيم كه قرمز رنگ است . سپس آنها را در داخل لوله آزمايش انتقال مي دهيم بعد روي آنها پنبه غير هيدروفيل مي گذاريم سپس لوله ها را در داخل يك بشر مي گذاريم ( يا ظرف ديگر ) اتوكلاو مي كنيم (121 درجه 15 بار 15 دقيقه ) .

در مورد SIM  به حالت قائم مي گذاريم تا سفت شود . ولي در مورد TSI جا لوله را كج ( مورب ) مي گذاريم .

Agr + آب مقطر                         Hot plate         داخل لوله آزمايش            پنبه غير هيدروفيل

 

بشر               اتوكلاو . 

 

از لحاظ تركيب محيط كشت را 4 قسمت مي كنيم .

1. غني كننده .
2. مغذي ( عمومي ) .
3. انتخابي .
4. افتراقي .

غني كننده عمدتا مواقعي استفاده مي شود كه ما بخواهيم باكتريهايي راكشت بدهيم كه يا تعدادشان كم است و يا اينكه در رقابت با ساير باكتريها رشدشان بسيار كم يا اينكه مهار مي شود .

محيط كشت مغذي ( عمومي ) تركيبشان به صورتي است كه همه باكتريها و يا به عبارتي اكثريت باكتريها مي توانند در آنها رشد بكنند و خود محيط ماهيتا نمي تواند حالت انتخابي براي يكسري از باكتريها باشد . مگر اينكه فاكتورهاي ديگري را مثل دما مدت انكوباسيون و هوازي يا بي هوازي بودن به آنها اعمال شود .

محيط هاي كشت انتخابي داراي تركيباتي هستند كه براي يكسري از باكتريها تشويق كننده و براي برخي ديگر خاصيت مهار كنندگي دارد و اين مي تواند يك حالت انتخابي را به وجود بياورد .

محيط كشت افتراقي را بر اساس خصوصيات بيوشيميايي باكتريها تقسيم مي كنند به اين معني كه با توجه به تفاوت هايي كه در رابطه با اعمال بيوشيميايي باكتريها بر روي محيط كشت انجام مي دهند و متعاقبا متابوليتهايي را آزاد مي كنند بر اين اساس مي توانيم باكتريها را از هم ديگر تخريب كنيم عمدتا اين محيط ها جهت تفريق باكتريهاي هم خانواده استفاده مي شوند . محيط نوترينت آگار يا مغذي كه جزء دسته دوم حساب مي شود و همه باكتريها ( اكثريت ) مي توانند در آن رشد كنند . ( زرد روشن مي باشد ) .

محيط دوم بلاد آگار كه قرمز خون دار بوده و محيطي عمومي است و به آن مقداري خون و فيبرينه اضافه مي كنند ( خوني كه فيبرينش گرفته شده ) تا قابليت ليز شدن گلبولهاي قرمز توسط باكتريها بررسي شود اين محيط طوري است كه حساس ترين باكتري ها هم در آن قابليت رشد پيدا مي كنند . ( رب مانند و همه مات هستند ) .

محيط Mac con key Agar : محيط انتخابي براي آنتروباكترياسه هستند چرا كه حاوي يكسري مواد مانند املاح صفراوي و كريستال ويوله بوده كه اين تركيبات به گرم مثبت ها اجازه رشد نمي دهند همچنين گرم منفي ها كه جزو آنتروباكترياسه نيستند در اين محيط نمي توانند رشد كنند اين محيط در درجه دوم يك محيط افتراقي هم به حساب مي آيد و مي توان توانايي باكتريها براي تخمير قند لاكتوز در آن را بررسي نمود زماني كه باكتريها بتوانند لاكتوز موجود در خون را تخمير كنند توليد يكسري متابوليتهاي اسيدي را مي كنند كه اين متابوليتهاي اسيدي در حضور معرف رنگي بنام قرمز خنثي به رنگ قرمز در مي آيند .

پس باكتريهايي كه لاكتوز مثبت هستند كلوني هايشان به رنگ قرمز ديده خواهد شد . ( شبيه مربا و قرمز روشن ) .

E.coli , kleb    +

Sal , prot         _

EMB ائوزين متيلن بلو آگار :

اين محيط داراي رنگ متيلن بلو است كه جزو رنگهاي آنيليني است و يك حالت انتخابي براي آنتروباكترياسه دارد و گرم + ها نمي توانند در آن رشد بكنند . همچنين داراي ويژگي خاص براي تشخيص اي كولاي است طوري كه كلوني هاي اي كولاي در EMB به رنگ سبز جلاي فلزي در مي آيد .          قرمز تيره ولي شفاف است .

محيط SS Agar ( Sallmonella,shigella Agar ) :

اين يك محيط انتخابي براي سالمونلا و شيگلا است . اولا با داشتن املاح صفراوي و سديم تيوسولفيدها به گرم + ها و گرم _ هايي كه خارج آنتروباكترها هستند اجازه رشد نمي دهند . همچنين داراي تركيباتي هستند كه براي سالمونلا و شيگلا مشوق رشد به حساب مي آيد مثل سيترات البته لازم به ذكر است كه به غير از سالمونلا و شيگلا ساير باكتريهاي خانواده آنتروباكترياسه مي توانند در اين محيط رشد بكنند همچنين در اين محيط تركيبات آهن دار هم وجود دارد كه از اين طريق مي توانيم توليد گاز SH₂ را توسط باكتري بررسي كنيم در اين صورت كه تركيبات آهن دار با SH₂ تركيب و توليد سولفيد آهن را مي كند كه رنگش سياه است و مي توان آن را در مركز كلوني ها مشاهده كنيم ( سالمونلا ) .

B.A              Steph

‌N.A              اورئوس

MCA           اي كولاي

SSA             كلپسيا

EMB            سالمونلا

مرور نتايج جلسه قبل :

Steph را كمي قارچ زده بود و قرمز رنگ بود .

اورئوس داراي سطح صاف و موم رنگ بود .

سالمونلا صورتي روشن و داراي سطح صاف بود .

كلپسيا صورتي فسفري ( شب تاب ) و نقطه اي بود .

كشت در چهار محيط جديد :

• آگار اوره
• گلوكز برات ( محلول گلوكز )
• SIM
• TSI

TSI : Triple suger Iron agar

در تركيب آن سه قند استفاده شده است : گلوكز ، لاكتوز ، ساكاروز .

هدف اين است كه بتوانيم قابليت تخمير قند توسط باكتري در محيط هوازي و بي هوازي را بررسي كنيم ، چرا كه از آنجايي كه قبلا اشاره شد در صورت رشد باكتري و تخمير قند باعث مي شود كه رنگ محيط از حالت قرمز به حالت زرد در بيايد همچنين به علت دارا بودن آهن مي توانيم توليد SH₂ را بررسي كنيم كه در بصورت توليد SH₂ رنگ سياه ايجاد مي شود . در كنار اينها ميتوانيم فاكتور توليد گاز را هم توسط باكتري بررسي كنيم اگر گاز + باشد ايجاد يكسري حبابهايي را در داخل محيط كشت مي كند و گاهي وقتها توليد گاز به حدي است كه حتي محيط كشت را از جاي خود بلند مي كند در اين محيط از رنگ فنول رد استفاده مي شود كه در PH حدود 8 به رنگ قرمز و در PH هاي كمتر از 6 به رنگ زرد ديده مي شود .

SIM :  SH₂ Indd Motility

در اين محيط سه فاكتور حركت ، توليد گاز SH₂ و توليد متابوليت ايندول بررسي مي شود . به لحاظ اينكه يك محيط نيمه جامد است بنابراين به راحتي مي شود رد پاي باكتري را در آن رد يابي كرد . همچنين در صورت توليد گاز SH₂  محيط به رنگ سياه در خواهد آمد . ايندول هم در بصورتي توليد مي شود كه باكتري داراي آنزيم تريپتوفاناز باشد و بتواند از اسيد آمينه تريپتوفان ايجاد ايندول را بكند كه باز با استفاده از يك آزمايش تكميلي مي توانيم وجود و توليد ايندول را توسط باكتري بررسي كنيم .

Glc Broth                   فنيل رد ( قرمز )               زرد رنگ

دو فاكتور بررسي مي شود :

1. تخمير گلوگز
2. توليد گاز

اوره آگار به صورت مورب ساخته مي شود براي بررسي قابليت تجزيه اوره توسط باكتري از اين محيط استفاده مي شود . باكتريهايي كه داراي آنزيم اوره آز هستند مي توانند اوره را تجزيه كنند . باكتريهايي مثل پروتئوس كه قدرت رشد و تكثير بالايي دارند مي توانند كه سريعا در اين محيط رشد كرده و اوره را تجزيه بكنند . در اين محيط از معرف فنول رد استفاده مي شود كه در PH هاي بالاتر از 8 به رنگ صورتي پر رنگ در مي آيد . يعني اگر باكتري اوره آز + باشد باعث تغيير رنگ به حالت صورتي پر رنگ خواهد شد .

براي بررسي نتايج 24 الي 48 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد داخل انكوباتور كافي است .

در TSI و SIM مي توان اي كولاي ، كلبسيلا ، و سالمونلا را كشت نمود . در اوره آگار كلبسيلا و سالمونلا . در گلوكز برات استاف و اي كولاي .

مواردي كه ما كشت داديم با بررسي بعد كشت به صورت زير بود .

در محيط SIM در دو لوله مجزا اي كولاي و كلبسيلا بود كه هر دو به رنگ زرد در آمده بودند .

در محيط TSI در دو لوله مجزا اي كولاي و سالمونلا بود كه اي كولاي به رنگ زرد و سالمونلا به رنگ ارغواني در آمده بود .

در محيط اوره آگار كلبسيلا بود كه به رنگ زرد نارنجي در آمده بود . ( اگر اوره منفي باشد رنگ خودش مي شود اگر اوره مثبت باشد به رنگ قرمز در مي آيد . )

در محيط گلوكوز برات استاف بود كه به صورت كپسولي در داخل مايع زرد رنگي ديده مي شد . همچنين جمع شدن گاز در لوله نيز مشهود بود .

حالتهاي مختلف رشد باكتري :

Black------ sh₂             yellow------- اسيدي                   Red---------قليايي

توليد يا عدم توليد ايندول يك فاكتور تفريقي است . عده اي مي توانند ( با استفاده از آنزيم تريپ توفان ) عده اي نه .

Trp----Indole, ammonia & Pyrovic Acid

Indole + kovacs reagent ------- Red color     شناسايي ايندول

kovacs reagent = HCL & دي متيل آمينو بنز آلدهيد & آميل الكل  

كواكسي زرد روشن است در صورتي كه در محيط ايندول باشد يك قسمت قرمز رنگ ديده مي شود . ( ايندول + ) .

كاتالاز تست :

يكسري از باكتريها قادرند كه اكسيژن 2 ظرفيت را تبديل سوپر اكسيد كنند كه براي باكتريها حالت سمي دارد . ولي يك تعداد از باكتريها هستند كه يك مكانيزم دفاعي بر عليه پراكسيد هيدروژن و سوپر اكسيد دارند . اينها د واقع داراي آنزيمي هستند كه مي تواند اين فرم از اكسيژن را مجددا به فرم دو ظرفيتي تبديل كند از آنزيم هاي مهم كه مي تواند اين واكنش را انجام دهد آنزيم كاتالاز است . آنزيم كاتالاز قادر است كه آب اكسيژنه را تجزيه كرده و آن را تبديل به آب و اكسيژن آزاد كند كه اين آزمايش در صورت مثبت بودن به صورت حبابهاي گاز در روي لام ديده خواهد شد .

تست Oxidase :

برخي باكتريها داراي آنزيم سيتوكروم اكسيداز a₃ هستند كه اين آنزيم جزئي از سيستم انتقال الكترون باكتري به حساب مي آيد وجود اين آنزيم را ما مي توانيم از طريق يكسري رنگهاي احياء شونده رديابي كنيم ، كه اين رنگها د مجاورت با اين آنزيم احياء شده و ايجاد رنگ بنفش را خواهند كرد .

اگر باكتري

اكسيداز مثبت باشد --------- بنفش

اكسيداز منفي باشد ---------رنگ كلوني

نام رنگ  ------------------ تترا فنيل پارا فنيلن دي آمين . Tetramethyl-p-phenylene di amine

تست كوآگولاز : Coagulase

هدف ؟ در اين تست هدف ما رديابي يكسري از گونه هاي استافيلوكوكوس است كه اينها قادرند پلاسماي خون را لخته بكنند . از آنجايي كه اين خاصيت نشان دهنده استافيلوكوكهاي بيماريزا هستند مثل استافيلوكوكوس آرئوس بنابراين يك تست بسيار مفيدي است جهت تفريق اين دسته از اسافيلوكوكها از ساير كوكسي هاي گرم + براي انجام اين آزمايش از دو روش استفاده مي شود كه البته در هر دو روش سوبستراي ما مشترك است و باكتري بر روي پلاسماي سيتراته آزمايش خواهد شد تا قابليت ايجاد كلات( Clot ) يا لخته تست شود .

روش لوله اي و روش روي لام :

در روش لوله كوآگولاز آزاد تشخيص داده مي شود براي انجام آزمايش يك مقداري از پلاسماي سيتراته را در داخل يك لوله آزمايش كوچك مي ريزيم سپس با استفاده از آنس حلقه از يك كشت تازه ( 18 الي 24 ساعته ) به داخل لوله منتقل ميكنيم و لوله را حدود 4 ساعت در 37 درجه انكوبه مي كنيم اگر كوآگولاز مثبت باشد در عرض 1 الي 4 ساعت لخته ايجاد خواهد شد . ( تا 24 ساعت هم نگه مي دارند ) .

روش روي لام :

يك قطره از پلاسماي سيتراته را روي لام قرار مي دهيم و يك مقدار از آن كلوني مورد نظر را در داخل اين كاملا حل مي زنيم ( سعي مي كنيم كه يكنواخت شود ) در طي چند ثانيه ( 30-15 ) بافت اين به صورت دانه دانه خواهد بود كه اين چون ريز است در زير لوپ خواهيم داشت.

آزمايشات انجام شده :

در مورد ايندول

كلپسيا ايندول منفي و سبز رنگ . اي كولاي ايندول مثبت و قرمز رنگ .

در مورد كاتالاز

اي كولاي ، سالمونلا ، استافيلوكوك حباب زدند پس كاتالاز مثبت .

در مورد اكسيداز

پاستورلا اكسيداز منفي مي باشد .

كوآگولاز: Coagulas

يا به شكل tube  مي باشد و يا Slide .

آزمايش اسلايد يا لام :

يك قطره آب مقطر + باكتري ( اول خوب هم مي زنيم و آرام آرام با آب مقطر مخلوط مي كنيم ) + سرم .

اگر در 30 ثانيه دون دون شود + اگر نشود – است . اگر حالت دون دون شدن بيش از 30 ثانيه طول كشيد مشكوك است و بايد از روش لوله استفاده شود .

آرئوس +          اپيدرميوس _

آزمايش قارچها :

Fungi

Medium: SDA,ME,PDA

Caltivation: Stabcultar & Slide culture

همواره يك رقابتي بين باتري ها وقارچها در محيط وجود داشته و همانطور كه ما سعي مي كرديم موقع كشت باكتريها از آلودگي و رشد قارچها پيشگيري كنيم موقع كشت قارچها نيز شرايط را بايد طوري تغيير دهيم تا باكتريها قادر به رشد نباشند . در اينجا نيز از يكسري محيط هاي اختصاصي براي قارچها استفاده مي كنيم .

Saouraud Dextrose Agar ( SDA ) using Abslike ( poly )

Malte Extrect ( ME )

Potato Dextrose ( PDA )       Decreased PH < 3.5

 

براي اينكه در اين محيط باكتريها قادر به رشد نباشند شرايط را طوري تغيير داده اند كه فقط قارچها بتوانند رشد كنند به طور مثال در 1 و 2 اين كار را با كاهش PH تا حدود كمتر از 5/3 انجام مي دهند يعني با افزودن اسيد PH را پايين مي آورند ( تا 5/3 ) يا در مورد 1 اين مهار را با استفاده از آنتي بيوتيك هايي مثل كلرادم فني كول و كولي پكسين انجام مي دهند .

نكته 1 : دماي انكوباسيون 25 درجه سانتيگراد و به مدت 24 الي 48 ساعت است .

نكته 2 : كشت باكتري به صورت Stab culture است .

ما آزمايش را در محيط SDA انجام داديم و مواردي را كه كشت داديم به قرار زير بود .

آسپرژيلوس فومگاتوس ،آسپرژيلوس ليجولنس ،آسپرژيلوس فلاووس ،آسپرژيلوس نايجر ،و پني سليوم .

در رنگ آميزي از لاكتوفنل كاتن بلو استفاده مي كنيم .

مشخصات قارچهاي كشت داده شده :

نيجولنس : سفيد بوده حالت پنبه اي و پودري دارد . داراي پرگنه هاي بزرگ مي باشد .

نايجر : كاملا سياه بوده و كاملا حالت پودري و ابري دارد و پرگنه ها كوچك تا متوسط است .

پني سليوم : پرگنه هاي متوسطي و زيادي دارد و داراي رنگ سيماني ( سبز مايل به خاكستري )  مي باشد . از پشت زرد رنگ ديده مي شود .

آسپرژيلوس فلاووس : به رنگ سبز يشمي است حالت پودري دارد و پرگنه ها بزرگ مي باشند ( به تعداد 5-4 عدد ) .

آسپرژيلوس فومگاتوس : مثل خزه بوده و ريز مي باشد ، رنگ آن سبز سپاهي بوده داراي پرگنه هاي كوچك بوده و برجسته است و مهم ترين مشخصه آن اين است كه دوره هاي آن سفيد مي باشد.

روش رنگ آميزي :

ابتدا رنگ را در روي لام گذاشته و بعد با آنس حلقه مقداري پرگنه بر ميداريم و داخل رنگ هم ميزنيم تا كامل رنگ را به خود بگيرد و بعد يك لامل روي آن قرار مي دهيم .

جهت تشخيص گونه هاي مختلف آسپرژيلوس از پرگنه ( رنگ ، قوام ، و اندازه پرگنه ) كمك گرفته مي شود.

كشت كپك ها :

A: Stab calture                                  B: Slide calture

روش B :

در اين روش از يك پليت شيشه اي كه كاملا استريل است استفاده مي كنيم . داخل آن يك كاغذ صافي مي گذاريم و يك مقدار هم آب مقطر مي ريزيم ، بعد لوله هاي هماتوكريت را در روي شعله به شكل U در مي آوريم . يك لام تميز بر مي داريم . محيط كشت SDA است كه از اين محيط بايد مقداري به لام انتقال دهيم ما از يك لوله آزمايش تميز و آنس استفاده مي كنيم . از نمونه اي كه قرار است كشت دهيم با آنس نوك تيز برداشته و در 4 نقطه كشت مي دهيم و آخرسر يك لامل روي آن مي گذاريم بعد به پليت شيشه اي منتقل مي كنيم و در آن را مي گذاريم سپس در انكوباتور 25 درجه سانتيگراد به مدت 4 روز مي گذاريم .

رنگ آميزي مخمرها :

از رنگ هاي مختلف مثل متيلن بلو ، سافرانين ، رنگ آميزي گرم  مي توان استفاده نمود . ظاهر آن شبيه به باكتري مي باشد .

نام مخمري كه ما مورد بررسي قرار داديم  Candida Albicans بود .

 بررسي كپك هاي كشت شده :

قسمتي كه به لامل چسبيده شده بود قسمت زايشي و قسمتي كه روي لام بود قسمت رويشي نام داشت . قسمت زايشي به دو رنگ آبي و سبز ديده مي شد .

آنتي بيوگرام :

آنتي بيوگرام يك روش آزمايشگاهي و ميكروبيولوژي است كه جهت ارزيابي حساسيت باكتريها نسبت به آنتي بيوتيك هاي مختلف در محيط خارج از بدن صورت مي گيرد . روش معمول براي اين كار كشت باكتري در محيط كشت مولر هينتون و سپس قرار دادن ديسك هاي حاوي آنتي بيوتيك هاي مختلف بر روي محيط كشت است .

مايع حاوي باكتري را با گوش پاك كن پخش مي كنيم و بعد 10 دقيقه صبر مي كنيم و سپس بر روي آن كلي آنتي بيوتيك پخش مي كنيم ، و بعد 48-24 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد در انكوباتور قرار مي دهيم . باكتري كه ما كشت داديم اي كولاي بود و از آنتي بيوتيك هاي زير استفاده كرديم .

Penicillin         P10

Kanamycin    K30

Cephalothin   CR30

Chloramphonicol      C30

Tetracychline TE30

Steptomycin   S10

Ampicillin       AM10

Meomycin      N30

بررسي آنتي بيوگرام :

براي اين كار با كوليس ورنيه قطري را كه هر آنتي بيوتيك اشغال مي كند را اندازه گرفته و از روي جداول مربوط به آنها تشخيص مي دهيم كه آيا اين آنتي بيوتيك بر باكتري كه كشت داده ايم حساس است يا نه .

نتاج حاصله به صورت زير مي باشد .

نام آنتي بيوتيك	اندازه قطري كه ايجاد كرده	اثر آنتي بيوتيك
TE30	18.6	مشكوك
N30	12.4	نيست
C30	21.3	حساس
S10	0	كاملا مقاوم ( بدون حساسيت)
AM10	15.5	مشكوك
CR30	20.4	حساس
K30	11.55	نيست

 

رنگ آمیزی متیلن بلو:

1- سطح گسترش رابه مدت 3تا4 دقیقه بارنگ بپوشانید سپس لام راباآب بپوشانید .

2- پس ازخشک شدن لام (در هوایاباکاغذ خشک کن) آنرا بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار می دهیم . دراین رنگ آمیزی باکتری به رنگ آبی مشاهدهمی شود .

رنگ آمیزی گرم :THE GRAM STAIN

این روش رنگ آمیزی یکی از مهمترین ومتداولترین روشهای رنگ آمیزی درباکتری شناسی است که اولین بار توسط کریسین گرم ابداع شد . دراین رنگ آمیزی باکتریها بر مبنای رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به دودسته گرم مثبت وگرم منفی تقسیم می شوند . رنگ باکتری پس ازرنگ آمیزی به توانایی حفظ رنگ اول وبه عبارتیبه ساختمان دیواره سلولی باکتری بستگی دارد . دررنگ آمیزی گرم باکتریهای گرم مثبت پس ازرنگ آمیزی به رنگ بنفش وباکتری های گرم منفی به  رنگ قرمز مشاهده می شود.

 

مکانیسم :

1- رنگ کریستال ویوله رابه مدت 30تا45 ثانیه برروی گسترش ریخته درنتیجه همه باکتری ها بهرنگ بنفش درخواهد درآمد.

2- پس از شستشو گسترش با آب به مدت 30تا45 ثانیه بالوگل می پوشانند لوگل باکریستال ویوله ترکیب شده وایجاد کمپلکس های بزرگی می نمایید که باعث تثبیت رنگ کریستال ویوله درداخل دیواره سلولی باکتری می شود . پس ازاین مرحله نیزکماکان همه باکتریها به رنگ بنفش مشاهده می شوند .

مرحله رنگ زدایی مهمترین مرحله رنگ آمیزی است دراین مرحله پس از شستشو لام با آب لام به مدت 15 تا20 ثانیه در معرض موادرنگ زدا مانند الکل استون قرار می گیرد سپس با آب مورد شستشو قرار می گیرد  . درباکتریهای گرم منفی که دارای لایه های پپتیدو گلیکان محدود وغشای خارجی غنی از چربی هستند این حلال باعث حذف این لایه ها وغشا می گردد وباکتری رنگ مراحل قبل راازدست می دهد . ولی درباکتریهای گرم مثبت به علت تعداد زیاد لایه های پپتیدوگلیکان وعدم وجود لیپید فراوان در غشا رنگ مرحله قبل ازغشا خارج نمی شود .درنتیجه پس ازاین مرحله باکتریهای گرم منفی بی رنگ ولی باکتریهای گرم مثبت کماکان بنفش باقی خواهند ماند .

 

4- در انتها سطح گسترش راباسافرانین یا فوشین (قرمز رنگ) به مدت 30 تا45 ثانیه می پوشانیم سپس باآب شستشو داده و پس از خشک شدن بامیکروسکوپ مورد بررسی قرار میگیرد . دراین مرحله باکتریهای بی رنگ به رنگ قرمز درمی آیند وباکتری های بنفش بدون تغییر رنگ باقی می مانند .

Gram stain of Staphylococcus aureus

رنگ آمیزی باکتری ها:
قسمت اول:
نحوه آماده سازی لام جهت رنگ آمیزی
1-تهیه گسترش:
گسترش میکروبی ممکن است از محیط کشت مایع یا جامد تهیه شود ابتدا بر روی یک لام ساده و تمیز یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی قرار می دهیم. فیلدوپلاتین را استریل کرده (بوسیله شعله ) و سپس با قرار دادن آن در کناره محیط کشت جایی که فاقد باکتری باشد خنک می کنیم. بوسیله فیلدوپلاتین حلقوی ازسوسپانسیون ,باکتری برداشت کرده روی لام قرار می دهیم و آن را پخش می کنیم. باید توجه داشته باشیم که در محیط های جامد کلنی باکتری را از منطقه 4 پلیت برداشت کنیم.کلنی باکتری را بوسیله فیلدوپلاتین در داخل آب پخش می کنیم. لامل را تحت زاویه 45 درجه بر روی لام قرار می دهیم. یک گسترش خوب گسترشی است که بعد از خشک شدن بر سطح لام یک لایه نازک سفید ظاهر شود.
2-خشک کردن گسترش:
لامی را که به طریقه بالا تهیه شده است را در معرض هوا یا در مجاورت گرما قرار می دهیم تا گسترش روی لام خشک شود.
3-ثابت کردن (فیکساسیون):
جهت ثابت کردن از حرارت مستقیم استفاده می کنیم.البته باید دقت کرد که حرارت آنقدر زیاد نباشد تا عناصر سلولی و میکروبها سوخته و غیر قابل تشخیص گردند و آنقدر هم کم نباشد که میکروبها ثابت نشوند.
برای ثابت کردن لام خشک شده را سه مرتبه از بالای شعله عبور می دهند و هر بار باید مقدار حرارت به قدری باشد که پشت دست را نسوزاند.در مواردی که با ساختارهای حساس باکتری مانند کپسول و تاژه کار می کنیم این مرحله حذف می شود.
نکته : برای تهیه گسترده از محیط کشت مایع ابتدا لوله را به آرامی تکان می دهیم تا باکتری های ته نشین شده را در محیط پخش کنیم.
نکته: گسترش را به اندازه 4/1 سطح لام پخش می کنیم.

انواع رنگ آمیزی :
رنگ آمیزی ساده : جهت مشاهده شکل و مورفولوژی باکتری و آرایش آنها
رنگ آمیزی افتراقی :
1-رنگ آمیزیهای متداول :
رنگ آمیزی گرم
رنگ آمیزی اسید فست

2-مشاهده ساختمان های مختلف :
رنگ آمیزی کپسول
رنگ آمیزی اسپور
رنگ آمیزی هسته
رنگ آمیزی تاژه

رنگ آمیزی ساده :
برای مقایسه شکلها و بررسی آرایش سلولهای باکتری است .در رنگ آمیزی ساده ترجیحا از رنگهای بازی (کروموژن با بار مثبت ) استفاده می شود زیرا اسیدهای نوکلئیک و ترکیبات خاص دیواره دارای بار منفی بوده و با کروموژنهای کاتیونیک پیوند برقرار می کنند.متداولترین نوع رنگهایی که در این نوع رنگ آمیزی استفاده می شود عبارتند از:
متیبن بلو, کریستال ویوله و کربول فوشین

قسمت دوم:

مراحل انجام کار رنگ امیزی ساده:

1-تهیه گسترش از باکتری مورد نظر

2- خشک کردن گسترش در مجاورت هوا

3- فیکسه کردن گسترش در مجاورت هوا

4- ریختن چند قطره رنگ متیلن بلو یا کریستال ویوله یا کربول فیشن برای 1 تا 2 دقیقه

5- شستشوی گسترش با آب به منظور خارج کردن رنگ اضافی از روی لام

6- استفاده از کاغذ جهت خشک کردن گسترش

7- بررسی میکروسکوپی

در طی مرحله 4 لام را باید به صورت افقی و در مرحله 5 باید لام را به صورت موازی با جریان آب نگهداشت.

در این نوع رنگ آمیزی برحسب نوع رنگ بکار برده شده میکروب ها به سه رنگ مختلف دیده می شوند:

رنگ آبی (متیلن بلو )

رنگ بنفش (کریستال ویوله )

رنگ قرمز(کربول فوشین )

رنگ آمیزی گرم :

یکی از متداول ترین رنگ آمیزی ها در آزمایشگاه میکروبشناسی می باشد که نخستین بار کریستین گرم در سال 1884 این روش را ابداع نمود و باکتری ها را به دو گروه اصلی تقسیم کرد:

باکتری گرم منفی و باکتری گرم مثبت

مراحل رنگ آمیزی گرم:

مراحل 1تا 3 را انجام می دهیم.

4-افزودن رنگ اولیه :

در این مرحله رنگ کریستال ویوله افزوده می شود به مدت 1دقیقه

5-سشتشو با آب

6- افزودن محلول لوگول که یک محلول تثبیت کننده است به مدت 1 دقیقه

7-شستشو با آّب

8-افزودن محلول رنگ بر ( الکل – استن )

این عامل دو عمل را انجام می دهد:

الف)حلال چربی است.

ب) دهیدراته کننده پروتئین ها است.

9-شستشو با آب

10-اضافه کردن رنگ سافرانین یا فوشین به مدت 30 تا 60 ثانیه

12-شستشو با آب

13- خشک کردن

در رنگ آمیزی گرم باکتری گرم مثبت به رنگ بنفش و باکتری گرم منفی به رنگ صورتی دیده می شود.

رنگ آمیزی منفی باکتری ها:

در این رنگ آمیزی باید از رنگ های اسیدی مانند مرکب چین یا هندی و یا نیگروزین استفاده کرد.رنگ های اسیدی با داشتن کروموژن با بار منفی قادر به نفوذ به درون سلول نمی باشد زیرا بار الکتریکی سطح سلول باکتری ها نیز منفی می باشد.بنابراین در این نوع رنگ آمیزی سلول های بدون رنگ باکتری در زمینه رنگی به سادگی قابل شناسایی است.

این نوع رنگ آمیزی بررسی باکتری هایی را که به سختی رنگ می گیرند را ممکن می سازد.در این روش عمل ثابت کردن گسترش توسط حرارت لازم نیست و سلولها در معرض اثرات خاص مواد شیمیایی و حرارت قرار نمی گیرند بنابراین اندازه و شکل سلول ها به صورت طبیعی مشاهده می شود.

قسمت سوم :
مواد لازم و روش تهیه رنگ برای رنگ آمیزی منفی:
مرکب هندی یا چین,مرکب رسم پلیکان شماره 17 جهت آزمایش پیشنهاد می شود.به عنوان محافظ 3/0% تری کروزول به آن می افزاییم.

روش رنگ آمیزی :
در روش رنگ آمیزی با مرکب هندی,کپسول ذرات کلوئیدی کربن مرکب را جذب کرده و در نتیجه به صورت یک هاله شفاف اطراف میکروارگانیسم مشاهده می شود .این روش برای مشاهده کپسول پنومونیه توصیه می شود.
1- یک قطره رنگ نیگروزین یا مرکب هندی را در یکی از دو انتهای لام قرار دهید.
2- یک لوپ پر از باکتری های مورد نظر را در قطره رنگ وارد کنید و با فیلدوپلاتین رنگ و باکتری ها را با هم مخلوط کنید.
3- یک لام دیگر برداشته و روی قطره رنگ حاوی باکتری ها قرار داده و بوسیله آن گسترش را آماده کنید.
خشک کردن گسترش و میکروسکوپی آن.
تفسیر رنگ آمیزی :
در این رنگ آمیزی باکتری ها بیرنگ , شفاف و در زمینه ای سیاه رنگ مشاهده می شود.

مشاهده ساختمان های مختلف باکتری :
1)رنگ آمیزی کپسول:
کپسول یک لایه ژلاتینی خارجی است که از سلول ترشح شده و آن را احاطه کرده و به دیواره سلولی متصل است.تمامی میکروارگانیسم ها قادر به تولید کپسول نمی باشد .سلول هایی که کپسول ضخیم دارند عموما بیماریزا می باشند زیرا این ساختمان باکتری را در مقابل عمل فاگوسیتوز سلول های میزبان محافظت می کند.
مراحل رنگ آمیزی کپسول _ روش جینز (jins ) :
1-تهیه گسترش از باکتری کپسول دار مانند کلبسیلا پنومونیه (Klebsiella pneumoniae )
2-خشک کردن گسترش در مجاورت هوا
3-اضافه کردن رنگ کریستال ویوله 2% به مدت 1 دقیقه
4-بسرعت آن را با جریان ملایم آب بشویید.
5-افزودن اسید استیک 1-2 % به مدت 10 ثانیه
6-شستشو لام با جریان ملایم آب
7- خشک کردن
8-مشاهده میکروسکوپی
در این روش جسم رویشی باکتری به رنگ آبی و کپسول به رنگ صورتی کمرنگ دیده می شود.
توجه :
لازم به ذکر است که در رنگ آمیزی کپسول نیازی به مرحله فیکس کردن به وسیله حرارت نیست زیرا حرارت سبب کوچک شدن سلول و ایجاد هاله شفاف کاذب می شود که ممکن است با کپسول اشتباه شود.
2)رنگ آمیزی اسپور :
اسپور حالت مقاوم سلول رویشی باکتری است . بعضی از باکتری ها در شرایط نامساعد محیط قابلیت تشکیل سلول مقاوم از سلول رویشی را دارند که در این حالت چون در درون سلول رویشی تشکیل می شود به آن اندوسپور گفته می شود هنگامیکه این فرم از سلول خارج می گردد به آن اسپور گفته می شود .
اسپور به دلیل داشتن پوششهای غیر قابل نفوذ در برابر شرایط نامساعد همچون کمبود رطوبت و دما و نور,
امواج رادیویی , مواد شیمیایی, انجماد, خشکی مقاوم می باشد.
اسپور زایی یک مرحله زایشی در چرخه سلول باکتری به حساب نمی آید بلکه یک مرحله استراحت (کمون ) بوده که در آن متابولیسم سلول غیر فعال شده و شرایط نامساعد را تحمل می کند.در صورت مساعد شدن شرایط اسپور قادر است به فرم رویشی تبدیل شود که این عمل طی سه مرحله انجام می شود عبارتند از:
فعال شدن ,جوانه زدن,تبدیل اسپور به فرم رویشی
مراحل رنگ آمیزی اسپور به روش مالاشیت گرین:
1-انجام مراحل 1 تا 3
4-افزودن رنگ مالاشیت گرین به مدت 10-15 دقیقه همراه با حرارت
سه نکته باید توجه شود:
ü رنگ خشک نشود.
ü رنگ نجوشد.
ü در صورت تبخیر مرتبا رنگ اضافه شود.
5-شستشو با آب
6-افزودن رنگ زمینه (سافرانین ) به مدت 1 – 2دقیقه
در این مرحله سلول های رویشی رنگ قرمز به خود می گیرند و به رنگ قرمز – صورتی دیده می شوند ولی اسپورها سبز دیده می شوند.
7- شستشو با آب
8- خشک کردن

.9 مشاهده میکروسکوپی

انواع محیط کشت:

کشت وتکثیر باکتریها در محیطهای مصنوعی از مهمترین روشهای تشخیصی در باکتر ی شتاسی است. برای کشت موفق باید شرایط مناسب برای رشد باکتری فراهم گردد. ازجمله این شرایط مواد غذایی - حرارت ورطوبت کافی-  نمک-  PH مناسب-  حضور یاعدم حضوراکسیزن می باشد .

امروزه کشت باکتریها اغلب برروی محیطهای کشت مصنوعی صورت میگیرد. محیطهای کشت علاوه برتامین نیازهای غذایی وبسیاری نیازهای دیگر دارای ترکیباتی هستند که در تشخیص وشناسایی باکتریها نیزموثرند. زمانی که غلظت میکروارگانیسم کم باشد باانجام کشت تعداد باکتریها را میتوان افزایش داد ..

 

محیط های کشت به دو دسته تقسیم میشوند:

 محیط مایع ومحیط جامد.

برای انجام کشت در محیط مایع کافی است مقداری از نمونه رابه محیط اضافه نماید. باکتری درمحیط مایع پس از مدت زمان لازم(حدود چهار ساعت)به صورت کدورت یکنواخت-  غیریکنواخت ویاپرده ظریفی درسطح محیط کشت ظاهر میشود.در صورتیکه باکتری در محیط جامد کشت داده شود پس ازمدت لازم (حدود شانزده الی هجده ساعت)بجز بعضی از مایکوباکترها(سه تا شش هفته)به صورت تودهای عظیمی درسطح محیط ظاهر میشود که کلنی نامیده می شود

 

اشكال محيط كشت:

1 - لوله كشت مايعBroth tubes : لوله هاي شامل محيطهاي مايع مي باشد نوترين از قبيل تريبتي كيس سوي براث شامل سوبسترا براي رشد ميكروب از قبيل بانكراس - كلريد سد يم كه بس از تلقيح به 3 فرم ديده مي شود :

 

1- غشا نازكPellicle شامل يك توده اركانيسم شناور دربالاي محيط كشت(see Fig. 7A)

 

2- مه ألوديTurbidity اركانيسم همانند ابردر محيط ديده مي شود(see Fig. 7B) 

 

3 - رسوبSediment توده اركانيسم ته نشين طاهر مي شود(see Fig. 7C).

 

2- لوله خوابيده(see Fig. 8A) و (see Fig. 8B)

 

3 -  Stab tubes (see Fig. 9)

 

4 - بليت أ كارAgar plates كلني هاي مختلف را مي توان بااستفاده از مدل فوق شرح دادAppendix A

 

محیط آگارخوندار

محیط کشت آگار خوندار یکی از محیطهای کشت مغذی است که رشدبسیاری ازباکتریها راتامین می کندوهمچنین ایجاد همولیز برروی این محیط به راحتی قابل بررسی است. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگار پایه لازم است محیط تادرجه چهل تا پنجاه درجه سانتیگراد خنک شود. دراین مرحله پنج میلی لیتر خون تازه به ازای هرصد میلی لیتر محیط افزوده وپس از مخلوط کردن درپلیت های استریل تقسیم کنید  

هموليز Bاستافيلوكوك اوروس

 

محیط شکلاتی:

محیط کشت آگار شکلاتی که درآن گلبولهای قرمز به صورت لیز وجوددارد ازمحیطهای کشت مغذی است که رشداغلب باکتریها راتامین میکند. برای تهیه این محیط پس ازتهیه آگارپایه گه همان پایه آگارخوندار است کافی است که خون دردرجه حرارت هشتاد درجه سانتیگراد به محیط اضافه شود

 

محیط مولر هینتون:

این محیط به عنوان یک محیط مغذی پایه برای بررسی آنتی بیوگرام مناسب است برای تهیه این محیط پس ازحل نمودن پودر دهیدراته محیط درآب مقطرواتوکلاونمودن محیط رادرپلیت های استریل تقسیم نمایید

 

محیط EMB:

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت جلوگیری می کندوبه عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتری های گرم منفی بسیار مناسب است. کلنی کلی باسیل برروی این محیط به صورت جلای فلزی یا درخشندگی متالیک ظاهر میگردند

 

محیط مک کانکی آگار:

در این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت جلوگیری می شودوبه عنوان یک محیط انتخابی پایه برای جداسازی باکتریهای گرم منفی مناسب است. کلنی ها  بر حسب استفاده باکتری ازلاکتوز بصورت لاکتوزمثبت(صورتی)ولاکتوز منفی(بی رنگ)ظاهر می شوند

MAC  محيط انتخابي وافتراقي است

ارگانيسم هاي گرم منفي رشد كرده وگرم مثبت هارشد نمي كنند كه به علت وجود بايل نمك و كريستال ويوله است

 

محیط SS:

این محیط از رشدباکتریهای گرم مثبت وبسیاری از باکتریهای گرم منفی جلوگیری می کندوبه عنوان یک محیط انتخابی برای جداسازی سالمونلاوشیگلابخصوص ازنمونه مدفوع بسیار مناسب است

 

محیط بایل اسکولین آگار:

این محیط به علت دارا بودن اسکولین وصفرابرای شناسایی آنتروکوک ازسایر استرپتوکوکها بسیار مناسب است. دراین محیط صفرابه برخی از استرپتوکوکها ازجمله آنتروکوک اجازه رشد میدهدوباعث لیز بسیاری از استرپتوکوکها می شودودر صورتی که باکتری قادر به هیدولیز اسکولین باشد گلوکزواسکولتین(یک مولکول الکلی می باشد)آزاد می شود سپس اسکولتین با یون فریک موجود در محیط ایجادکمپلکس سیاه رنگ می شود

 

محیط لیزین آیرون آگار:

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در دکربوکسیلاسیون و دامیناسیون لیزین استفاده میشود.محیط مزبور را پس از تهیه در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود   

محیط مانیتول سالت آگار :

در این محیط به علت حضور 7.5% نمک از رشد بسیاری از باکتریها جلوگیری شده ولی اساتفیلو کوکها به خوبی رشد می نماید . این محیط همچنین حاوی قند مانیتول و معرف فنول رد می باشد و در صورتی استافیلوکوک مورد نظر قادر به تخمیر مانیتول باشد باعث اسیدی شدن محیط و تغییر رنگ معرف به زرد می شود

 

محیط کلیگر آیرون آگار :

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در تخمیرقند گلوکز و لاکتوز استفاده می شود . پس از تهیه محیط حدود 5 تا 7 میلی لیتر از محیط را در لوله های استریل تقسیم نموده و لوله را به صورت شیب دار قرار دهید تا محیط به آرامی سرد و منجمد شود

 

محیط مالونات :

از این محیط برای بررسی توانایی باکتری در استفاده از مالونات سدیم به عنوان منبع کربن استفاده می شود . تغییر رنگ محیط از سبز به آبی نشانه مثبت بودن تست است

محیط SIM :

از این محیط برای بررسی حرکت باکتری توانایی احیای گوگرد و تولید SH2 و تست اندول استفاده می شود.

باکتریهای هوازی:

باکتریهایی هستند که درفقدان مولکول اکسیزن قادربه رشد نمی باشند. این باکتریها به راحتی درهوای اتاق رشد می نمایند وانکوباتورهای معمولی به راحتی رشد آنهاراتامین میکنند

باکتریهای بی هوازی اجباری:

باکتریهای هستند که فقط درشرایط فاقدمولکول اکسیزن قادر به رشدمیباشند. بسته به میزان حساسیت این گروه به اکسیزن می توان از روشهای متفاوت برای تامین شرایط موردنیاز رشد آنهااستفاده کرد.

ازجمله روشهای معمول انکوباتورهای بی هوازی هستند که هوای داخل انکوباتور بامخلوطی ازگازهای نیتروزن هیدروزن ودی اکسیدکربن جایگزن می گردد. همچنین می تواندازگازپک مخصوص بی هوازی جهت تولید شرایط عدم حضور اکسیزن استفاده کرد

 

بررسی حساسیت باکتری نسبت به آنتی بیوتیکها(آنتی بیوگرام):

جهت درمان لازم است که حساسیت باکتریها نسبت به آنتی بیوتیکها تعیین گردد. از ساده ترین روشها رقت لوله ای تعیینMIC  وروشهای نفوذ درآگار میباشد

درروش نفوذدرآگار دیسکهای حاوی مقدارمشخص واستانداردآنتی بیوتیک رابروی آگار مغذی که باکتری موردنظر روی آن کشت شده قرار می دهند. این عمل باعث نفوذ آنتی بیوتیک درآگار می شود.

جهت انجام آنتی بیوگرام معمولا از محیطهای کشت مولر هینتون و  آگار خونداروآگار شکلاتی استفاده می گردد. هر چه باکتری نسبت  به آنتی بیوتیک حساستر باشدوغلظتهای کمتر آنتی بیوتیک قابلیت ممانعت از رشد باکتری راداشته باشد قطر هاله عدم رشدبیشتر می شود نتایج این روش به صورت حساس نیمه حساس ومقاوم گزارش می شود.

 

تعیین تعداد باکتری:

روشهای متعددی وجود دارد که ازآنجمله می توان به روش شمارش کلنی وکدورت سنجی اشاره کرد .روش کدورت سنجی  ازسادهترین روشهای تعیین تعداد باکتری ها درسوسپانسیون باکتری است .برای سنجش کدورت سوسپانسیون می توان کدورت آن راتوسط دستگاه توربیدومتر اندازه گیری وباجداول مربوطه مقایسه وتعداد باکتری رااعلام نمود ویا کدورت سوسپانسیون را باکدورتهای استاندارد بطورماکروسکوپی توسط چشم مقایسه نمود .

Mac Farland Nephelometery Standards لوله های مک فارلند را می توان با کمک مخلوط نمودن اسید سولفوریک 1 درصد وکلرید باریم 1 درصد (یک گرم در 100 سی سی آ ب مقطر) براساس جدول زیر تهیه نمود

 

اشكال محيط كشت:

1 - لوله كشت مايعBroth tubes : لوله هاي شامل محيطهاي مايع مي باشد نوترين از قبيل تريبتي كيس سوي براث شامل سوبسترا براي رشد ميكروب از قبيل بانكراس - كلريد سد يم كه بس از تلقيح به 3 فرم ديده مي شود :

1- غشا نازكPellicle شامل يك توده اركانيسم شناور دربالاي محيط كشت(see Fig. 7A)

2- مه ألوديTurbidity اركانيسم همانند ابردر محيط ديده مي شود(see Fig. 7B) 

3 - رسوبSediment توده اركانيسم ته نشين طاهر مي شود(see Fig. 7C).

2- لوله خوابيده(see Fig. 8A) و (see Fig. 8B)

3 -  Stab tubes (see Fig. 9)  

۴ - بليت أ كارAgar plates كلني هاي مختلف را مي توان بااستفاده از مدل فوق شرح دادAppendix A

 

استافیلوکوک:

استافیلوکوکوس(به انگلیسی: Staphylococcus) (در زبان یونانی به معنای خوشه انگور می‌باشد) به طور عام نام گروهی از باکتری‌ها است که در زیر میکروسکوپ به صورت گرد (کوکسی) بوده و کنار همدیگر و به شکل خوشه انگور قرار گرفته‌اند.

استافیلوکوک‌ها سی ‌و سه زیرگونه دارند. آنها اکثرا بی خطرند و به صورت طبیعی روی پوست اکثر افراد وجود دارند و در خاک نیز زندگی می‌کنند اما گونه‌های بیماریزا نیز در بین استافیلوکوک‌ها وجود دارند که می‌تواننمسمومیت غذایی و استفراغ ایجاد کنند و یا گاهی عفونت‌های خطرناک منجر به مرگ، همچون ذات‌الریه بدهند.

از شایع‌ترین زیر گونه‌های استافیلوکوک می‌توان گونه بیماریزای استافیلوکوکوس اورئوس(به انگلیسی: Staphylococcus aureus) و گونه استافیلوکوکوس اپیدرمیدس(به انگلیسی: Staphylococcus epidermidis) را نام برد.

گاهی اوقات عفونت‌های استافیلوکوکی به‌ویژه انواعی که در بیماران بستری در بیمارستان رخ می‌دهند به اکثر آنتی بیوتیک‌های موجود مقاوم هستند و بسیار خطرناک می‌شوند که به این نوع از استافیلوکوک‌ها MRSA می‌گویند.

 

دید کلی

باکتریها مهمترین و متنوع‌ترین میکروارگانیسمها هستند و تعداد کمی در انسان جانوران و سایر موجودات بیماریزا بوده و بطور کلی بدون فعالیت آنها حیات بر روی زمین مختل می‌گردد. تنها تعداد کمی از باکتریها مانند کلامیدیاها و ریکتزیاها اجبارا انگل داخل سلولی هستند. باکتریها از جنبه‌هایی با یوکاریوتها تفاوت دارند. باکتریها ریبوزومهای 80S ، اندامکهای غشادار مانند هسته ، میتوکندری ، کروموزوم حلقوی بدون پوشش دارند. باکتریها (به غیر از میکوپلاسماها) دارای دیواره سلولی هستند.

بطور یقین موجودات زنده یوکاریوتیک از موجودات زنده باکتری مانند بوجود آمده‌اند و نظر به اینکه باکتریها ساختمان ساده‌ای داشته و می‌توان به آسانی بسیاری از آنها را در شرایط آزمایشگاه کشت داد و تحت کنترل درآورد ، میکروب شناسان مطالعه وسیعی درباره فرآیندهای حیاتی آنها انجام داده‌اند. در این مبحث باکتریهای شایع با تاکید بر انواع بیماریزا در انسان معرفی می‌گردد.

 

اسپیروکتها:

این باکتریها در آبهای آلوده ، فاضلابها ، خاک و مواد آلی در حال پوسیدن یافت می‌شوند. به شکل فنر پیچیده و متحرک هستند. اندازه آنها از چند میکرون تا 500 میکرون است. سه جنس از اسپیروکتها بیماریزا هستند:

تروپونما: شامل گونه تروپونما پالیزم است که این باکتری عامل مولد بیماری سیفلیس می‌باشد.

بورلیا: این باکتری عال مولد بیماری تب راجعه می‌باشد.

لپتوسپیرا: این باکتری از راه شکافها و زخمهای پوست وارد می‌شود و شایع‌ترین شکل بیماری ، عفونت کلیه است.

کوکوسها و باسیلهای گرم منفی هوازی:

جالب‌ترین باکتریها در این گروه انواع متعلق به جنس سودوموناس است یکی از گونه‌های سودوموناس ، سودوموناس آئروجینوزا می‌باشد که این باکتری عفونتهای مجاری ادراری ، عفونتهای زخمی و سوختگیها ، آبسه و مننژیت را ایجاد می‌کند. باکتریهای این گروه قادر به ساختنآنزیمهای متعددی هستند و بدین نحو در تجزیه مواد شیمیایی نظیر حشره کشهایی که به خاک افزوده می‌شوند، کمک می‌کنند. مقاومت این گروه به آنتی بیوتیکها از نظر پزشکی حائز اهمیت است.                  

باسیلهای گرم منفی بی‌هوازی اختیاری

 

  آنتروباکتریاسه :

این خانواده شامل گروهی از باکتریهای ساکن روده انسان و سایر جانوران است. جنسهای باکتریهای روده عباتند از: اشیرشیا ، شیگلا ، کلبسیلا ، آنتروباکتر و ... . اشیرشیاکلی یکی از ساکنین اصلی روده بوده و آشناترین میکروبی که پژوهشهای فراوانی بر روی آن صورت گرفته است. سالمونلا یکی از باکتریهای بیماریزا است که یکی از گونه‌های آن مولد بیماری تب تیفوئید می‌باشد. گونه‌های شیگلا عامل اسهال خونی است. کلبسیلا عامل عفونت مجاری تنفسی ذات‌الریه است. سرشیا عامل عفونت ادراری و تنفسی است و آنتروباکتر در عفونتهای مجاری ادراری نقش بر‌عهده دارند.

 

ویبریوناسه :

جنسهای مهم این خانواده شامل ویبریو و آئروموناس می‌باشد. گونه بیماریزا ویبریوکلرا است که عامل بیماری وبا می‌باشد. باکتریهای متعلق به آئروموناس عامل بیماری ذات‌الریه و اختلالات روده می‌باشند.

 

هموفیلوس :

یکی از گونه‌های آن به نام هموفیلوس آنفلوآنزا عامل مننژیت در کودکان و جوانان می‌باشد.

 

باکتریهای گرم منفی بی‌هوازی :

در این گروه دو جنس مهم از نظر پزشکی به نامهای نایسریا و موراگزلا وجود دارد. نایسریا از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است و انگل غشاهای مخاطی در انسان بوده و درجه حرارت نزدیک درجه حرارت بدن انسان زندگی می‌کند، گونه‌های بیماریزا شامل باکتری مولد بیماری سوزاک و باکتری مولد مننژیت می‌باشد. باکتریهای جنس موراگزلا در التهاب بافت ملتحمه چشم دخالت دارند.

 

کوکوسهای گرم منفی بی‌هوازی :

این باکتریها اختصاصا به صورت دوتایی ، گاهی تک‌تک ، خوشه‌ای یا زنجیری قرار می‌گیرند. و همگی بدون حرکت و بدون اسپور هستند. باکتریهای متعلق به جنس ویلونلا بخش از میکروفلور طبیعی دهان و پلاک دندانی هستند.

 

کوکوسهای گرم مثبت :

این گروه از باکتریها از نظر پزشکی شامل دو جنس استافیلوکوکوس و استروپتوکوکوس هستند. عده‌ای از باکتریهای استافیلوکوکوس مواد سمی تولید می‌کنند که گویچه‌های قرمز خون و گویچه‌های سفید خون را نابود می‌کنند. چندین نوع عفونت استافیلوکوکی بوسیله گونه استافیلوکوکوس اورائوس ایجاد می‌شود که در ایجاد عفونتهای پوستی ، ذات‌الریه و آبسه‌های مغزی دخالت دارند. استرپتوکوکها در تب زایمان ، تب مخملک ، گلودرد ، تب روماتیسمی و پوسیدگی دندان دخالت دارند.

 

باسیلها و کوکوسهای اسپوردار:

دو جنس مهم اسپوردار باسیلوس و کلسترویدیوم می‌باشند. با‌سیلوس آنتراسیس عامل بیماری سیاه زخم که معمولا در گاو ، گوسفند و اسب بیماری تولید می‌کند، می‌تواند به انسان انتقال پیدا کند. باکتریهای متعلق به جنس کلستریدیوم بی‌هوازی اجباری هستند و بیماریهایی که تولید می‌کنند شامل کزاز و بوتولیسم می‌باشد.

 

باکتریهای میله‌ای شکل گرم مثبت بدون اسپور:

مهمترین این گروه جنس لاکتو باسیلوس می‌باشد. لاکتوباسیلوسها در روده و حفره دهانی زندگی می‌کنند. در دهان این باکتریها نقشی در پوسیدگی دندان به عهده دارند. در صنعت از این باکتریها برای تولید کلم شور ، دوغ و ماست استفاده می‌شود. باکتری بیماریزای متعلق به این گروه "یستریا منوسایتوجنز" است که در تولید آبسه ، انسفالیت و آندوکاردیت ، دخالت دارد.

 

اکتینومیستها :

از جنسهای مهم این گروه می‌توان کورینه باکتریوم ، مایکوباکتریوم ، نوکاردیا ، اکتینومیسس و استرپتومایسس را نام برد.

معروفترین و شناخته شده ترین گونه کورینه باکتریوم ، کورینه باکتریوم دیفتریا می‌باشد که عامل بیماری دیفتری می‌باشد.

دو گونه مهم مایکوباکتریوم توبرکلوزیسکه عامل سل و مایکوباکتریوم لپرا که عامل جذام می‌باشد.

گونه‌های متعلق به نوکاردیا در عفونتهای ریوی و عفونت مخرب دست و پا دخالت دارند.

 

ریکتیساها :

این گروه شامل ریکتسیا و کلامیدیا می‌باشند. این دسته از باکتریها ، انگلهای درون سلولی اجباری هستند که فقط در درون سلول میزبان قادر به تولید مثل هستند و از این لحاظ به ویروسها شباهت دارند. یکی از بیماریهایی که عامل مولد آن ریکتسیا می‌باشد، تیفوس است که بوسیه شپش منتقل می‌شود ، گونه‌هایی از کلامیدیاها موجب کوری در انسان می‌شوند.

 

مایکوپلاسما:

مایکوپلاسما باکتریهای فاقد دیواره سلولی هستند. مهمترین گونه بیماریزا در انسان مایکوپلاسما نومونیا است که عامل ذات‌الریه ابتدایی آتیپیک می‌باشد. این بیماری در بخش فوقانی دستگاه تنفس و ندرتا مانند سایر ذات‌الریه‌ها ، عارض می‌شود.

 

اشریشیاکلی:

اشریشیا کُلی که به ای‌کلای‌ یا کُلی باسیل نیز معروف است، یک باکتری گرم منفی از خانواده انتروباکتریاسه که در سال ۱۸۵۵ کشف شد. این باکتری بیهوازی اختیاری و بدون اسپور می‌باشد. اشیرشیا کلی‌ها اغلب متحرک می‌باشند. کلی باسیل قادر به تخمیر گلوکز وتولید گاز است وهمچنین لاکتوز راتخمیر می‌کند و اوره‌آز منفی است.

 

فلور روده:

اشریشیا کُلای معمولا جزء فلور نرمال روده می‌باشد و در در روده بزرگ انسان به فراوانی یافت می‌شود .

 

بیماریزایی:

اغلب تیپهای این باکتری در روده بیماریزا نیستند ولی برخی از تیپهای آن مانند تیپهای (Enterotoxigenic E. coli (ETEC با تولید سم و تیپهای ( Enteropathogenic E. coli (EPEC با آسیب مستقیم و تیپهای (Enteroinvasive E. coli (EIEC) با تهاجم بافتی می‌توانند ایجاد اسهال بنمایند . اسهال اغلب خفیف است ولی در تیپهای مهاجم تر مانند (EHEC) می‌تواند خونی باشد. مهمترین عامل اسهال مسافران اشرشیاکلی (به خصوص تیپهای (ETEC) می‌باشد . البته باکتریهایی مانند شیگلا و کامپیلو باکتر نیز می‌توانند عامل اسهال مسافران باشند . درکودکان زیردوسال ایزوله کردن آن ازمدفوع ارزش تشخیصی دارد. اسهال مسافران اغلب نیازی به درمان آنتی بیوتیکی ندارد و فقط باید اتلاف آب و الکترولیت را جبران نمود وکمتر از یک هفته بهبود می‌یابد. ولی در موارد شدید از کینولونها مانند سیپروفلوکساسین و نالیدیکسیک اسید می‌توان استفاده کرد. گونه‌های اشریشیا کلی در خارج از روده مثلا در مجاری ادراری ، ملتحمه و ... نیز می‌توانند بیماریزا باشند.

 

کاربرد در ژنتیک:

اشریشیاکلای نخستین جانداری که باروش‌های مهندسی ژنتیک مورد دست ورزی ژن قرار گرفت، در DNA حلقوی این باکتری باز گوانین (G) بیشتر از سایر بازها حضور دارد.

 

نحوه استفاده از اشریشیا کلی در ژنتیک مولکولی:

تعداد باکتری‌های اشریشیا کلی حاوی پلاسمید مورد آزمایش در اثر تکثیر باکتریایی زیاد می‌شود و در نتیجه تعداد پلاسمید‌های کپی‌شده در باکتری‌ها نیز افزایش می‌یابد به این دلیل در ژنتیک مولکولی از این نوع باکتری بسیار استفاده می‌شود. برای این منظور با استفاده از روش همتاسازی مولکولی سکانس موردنظر را وارد پلاسمید می‌کنند و سپس پلاسمید مورد نظر را با روش شوک گرمایی وارد باکتری‌های اشریشیا کلی می‌کنند. پس از تکثیر این باکتری‌ها روی پلاک حاوی آنتی‌بیوتیک و ال.ب. (L-Broth) و قرار دادن پلاک حاوی باکتری در ۳۷ درجه سانتیگراد (معمولا حداقل به مدت ۱۲ ساعت) با استفاده از روش‌های miniprep, midiprep, maxiprep (بستگی به مقدار دی‌ان‌ای مورد نیاز برای آزمایش دارد) دی‌ان‌ای موجود در باکتری اشریشیا کلی را از آن خارج می‌کنند و سپس از آن در انتقال به داخل سلول‌ها (transfection) و ... استفاده می‌شود.